3.結果和討論

通過CD光譜（圓二色光譜和支持信息中的圖S3）和表麵壓力測量（圖S4）對HSA-TR和野生型HSA進行比較表明，染料標記僅輕微幹擾HSA的二級結構和疏水性。通過Langmuir-Schaefer技術和AFM，粉色视频网站證明了在AWI處形成的蛋白質膜可轉移到雲母表麵，並且類似於一層蛋白質層厚(∼3 nm）用於HSA-TR和HSA（圖S5）。這與先前的中子反射率研究（建議為單層）非常一致。16因此，最小標記、接近天然的HSA為通過熒光顯微鏡研究AWI組裝提供了有用的模型蛋白質樣品。

在圖1中，HSA-TR溶解在PBS中（離子強度=193 mM），並在前麵所述的小室裝置中成像（圖1A）。當HSA-TR（[HSATR]）的濃度大於或等於0.050 mg/mL時，通過共聚焦顯微鏡觀察到均勻的熒光層，如圖1B所示。光學分辨率為∼0.2μm，4倍變焦圖像（圖1C）顯示界麵層沒有特殊結構。然而，當[HSA-TR]小於或等於0.025 mg/mL時，在界麵處觀察到高度不均勻結構，如圖1D所示。放大圖像（圖1E）顯示HSA-TR組裝成微米大小的分形結構。XZ平麵圖像進一步證實了不同的結構，圖1F中觀察到厚度均勻的熒光層，而圖1G中觀察到不連續的熒光層。粉色视频网站的結果表明，在PBS中離子強度為193mm的條件下，表麵飽和體積溶液濃度（CB sat）在0.025和0.050 mg/mL之間。在CB sat以下，吸附的蛋白質不能完全覆蓋AWI，因此允許在界麵處形成蛋白質結構域。以前使用張力測定法和橢偏法的報告發現，覆蓋AWI的BSA臨界濃度在10-2和10-1 mg/mL之間，13這與粉色视频网站的結果非常吻合。

盡管蛋白質吸附領域的研究人員普遍接受CB sat的概念，13,34但很少有研究揭示了濃度低於WCB sat的組裝蛋白質的微觀結構。Powers等人報告了在AWI上觀察到由兩親性肽形成的相結構域。23 Lee等人最近利用微流變學進行的一項研究表明，在相對較低的濃度下，AWI的β-乳球蛋白層中存在機械不均一性。在粉色视频网站之前的研究中，在用俄勒岡州綠標記的人纖維蛋白原的AWI處也觀察到不連續的熒光層，如果蛋白質在類似的緩衝條件下以0.01 mg/mL溶解。30早期基於2D晶格的模擬預測，在低濃度下，可通過擴散限製聚集形成分形網絡。36 AWI處的XY平麵圖像（圖1E）證實了在低亞相濃度下AWI處存在分形組裝和AWI處的異質蛋白質層。

然後，粉色视频网站改變溶液的離子強度和氧化還原狀態，並監測AWI形成的蛋白質組裝體。在將溶液移液到腔室後，在成像之前將界麵老化1小時。PBS中0.010 mg/mL HSA-TR（離子強度=53 mM）的樣品在界麵不同位置顯示出分形組裝（圖2A）和相互連接的“瑞士幹酪”結構（圖2B）。XY平麵圖像的Z疊層顯示了相同條件下界麵蛋白質層的高分辨率3D圖像（圖2C）。3D圖像是尺寸為45.0*45.0μm2的多個XY平麵圖像的疊加，這些圖像沿AWI上方和下方的Z軸采集，每個方向10μm（200*0.1μm步長）。這證實了界麵處的“瑞士奶酪”結構，並且幾乎沒有顯示來自亞相的熒光信號。雖然沿Z軸的光學分辨率是∼2μm對於共焦圖像，其比估計的蛋白質層厚度（30-40Å）大得多，Z-stack圖像清楚地表明蛋白質結構域僅在AWI處形成，並且與在XY平麵形成的結構域（數百微米）相比，Z方向上的組裝受到限製。

圖2。蛋白質組裝的形態，隨離子強度和還原劑的添加而變化。HSATR（0.01 mg/mL）在（A，B）PBS中的AWI下自組裝，pH值7.2，離子強度=53 mM和（C）在掃描體積為45.0*45.0*20.0μm3的情況下，呈現了與圖像B相同的溶液條件對應的共焦圖像Z疊層。（D）PBS，pH值7.2，離子強度=530 mM。（E）30 mM DTT，pH 7.2，離子強度=53 mM的PBS。比例尺：20μm。

在保持蛋白質濃度不變的情況下，粉色视频网站將緩衝液的離子強度增加到530mm。老化1小時後，粉色视频网站觀察到均勻熒光層（圖2D），表明表麵過剩增加，平衡時間縮短。在緩衝液中含有30mmDTT（圖2E）的樣品中，觀察到小的分形結構，表明吸附蛋白質之間的相互作用較弱。粉色视频网站還研究了HSA-TR在高離子強度（530mm）的PBS中溶解時界麵層形成的動力學。觀察到從密集分形（圖3A）到瑞士奶酪結構（圖3B）以及最終到均勻熒光層（圖3C）的明顯轉變。在大約30分鍾內，AWI達到平衡，形成均勻的熒光層。Dhar等人最近的一項研究發現，隨著時間的推移，BSA層的表麵粘度急劇增加，並推斷出組織結構發生了變化。37粉色视频网站的研究直接顯示了從分形到均勻組織層的形態轉變，這可以解釋觀察到的抗剪切性增加。

圖3。顯示異質結構域轉變為同質層的熒光圖像。C（HSA-TR）=PBS中的0.01 mg/mL，pH值7.2，離子強度=530 mM。（A）3、（B）8和（C）將蛋白質溶液引入試驗箱後36分鍾。標尺：50μm。

粉色视频网站的結果表明，溶液條件可以調節蛋白質自組裝的結構。HSA的等電點約為4.7。24因此，在pH值為7.2時，HSA-TR帶負電。靜電排斥強烈影響HSA-TR在AWI處的聚集，導致低包裝效率，如圖2A，B所示。分形結構和瑞士幹酪結構共存表明非平衡狀態，這是由於蛋白質從亞相的緩慢吸附受到界麵上已經存在的帶電蛋白質的排斥力的阻礙。在較高的離子強度下，帶電蛋白質分子之間的靜電斥力被更有效地屏蔽，HSA-TR吸附到界麵的速度更快，並且能夠更緊密地堆積，從而形成更均勻的層。如圖2D和3C所示，AWI的完全覆蓋率低於CB sat。在較低的離子強度（193 mM）下，在吸附時間1 h後，測定CB sat在0.025和0.050 mg/mL之間的值。在較高的離子強度（530mm）下，由於被吸附的蛋白質和來自塊體的蛋白質之間的排斥作用較小，因此塊體溶液蛋白質對AWI的吸附更快。此外，蛋白質分子在界麵上的堆積效率更高，從而實現了更高的蛋白質覆蓋率。

據報道，吸附在AWI上的蛋白質可以形成分子間二硫鍵，從而穩定蛋白質網絡並增強吸附層的彈性。38 HSA有一個反應性半胱氨酸，Cys34，可在AWI處與相鄰蛋白質形成二硫鍵。此外，吸附後構象的變化可能導致分子內二硫鍵的斷裂，為分子間二硫鍵的形成提供更多的反應位點。DTT等還原劑抑製分子間二硫鍵的形成，因此隻剩下小聚集體，這些聚集體可能通過疏水相互作用結合在一起。Vogler等人應用界麵流變學來研究AWI處的HSA，並發現吸附層既具有粘性又具有彈性。28二硫鍵的形成支持彈性來自分子間相互作用網絡的假設。有趣的是，利用BSA進行的微流變學研究發現，蛋白質膜主要是粘性的，沒有形成強的分子間鍵。37因此，AWI處蛋白質二硫鍵的作用可能在不同的蛋白質係統中有很大差異。

最後，將FDA批準的表麵活性劑F-127添加到HSA-TR溶液中，以改變AWI處吸附物種之間的疏水相互作用。疏水相互作用導致蛋白質中疏水單元的組裝或聚集，從而降低溶劑化能。39在蛋白質組裝中，多個蛋白質分子的疏水斑塊傾向於聚集在一起，將水從其表麵排除，從而增加係統的熵。40當添加更疏水的表麵活性劑時，它與蛋白質-蛋白質疏水相互作用競爭。已知表麵活性劑在AWI處與蛋白質相互作用，顯著降低表麵張力並改變表麵層的流變行為。41如Morris等人先前AFM研究中的“造山”模型所述，表麵活性劑以非均勻方式從AWI置換蛋白質。19然而，隻有BAM研究18提供了現場測量的直接證據，動態轉變的各個方麵仍然未得到充分探索。

通過粉色视频网站的原位熒光顯微鏡方法，粉色视频网站在HSA-TR/F-127混合物的AWI處發現了熒光強度較強和較弱的區域，表明發生了相分離。蛋白質在AWI處形成粘彈性網絡，導致蛋白質的分子遷移率比蛋白質-表麵活性劑混合物的分子遷移率小2個數量級。41因此，粉色视频网站預計富含蛋白質區域的熒光恢複速度應比表麵活性區域慢得多。為了驗證這一假設，粉色视频网站進行了FRAP實驗，用HSA-TR/F-127溶液（HSA-TR為0.10 mg/mL）和F-127溶液（HSA-TR為0.0050 mg/mL）評估界麵層的流動性。用近紫外激光束同時漂白強熒光和弱熒光區域的兩個圓形區域20 s。在之前和之後拍攝圖像使用衰減的543nm激光作為激發源進行漂白。照射90秒後，左上方的漂白區變小，25分鍾後，強度幾乎完全恢複；然而，右下方的漂白區域並未隨時間改變形狀或強度（圖4）。因此，粉色视频网站得出結論，強度恢複率的巨大差異表明界麵上“富含蛋白質”和“富含表麵活性劑”區域的分離。熒光強度較強的區域主要由HSA-TR組成，熒光強度較弱的區域主要由HSA-TR與F-127混合組成。表麵活性劑富集區的蛋白質被表麵活性劑分子分離，更容易擴散，使得HSA-TR的橫向遷移率遠高於蛋白質富集區。然而，熒光恢複期間漂白區形狀的變化表明，富含表麵活性劑的區域中的質量傳輸不均勻。結合多種擴散過程的適當分析方法，FRAP實驗有可能確定AWI處蛋白質分子擴散係數的分布。

圖4。界麵層光漂白後的熒光恢複。ROI（黃色圓圈）是選定的光漂白區域。ROI-1位於富含表麵活性劑的區域，而ROI-2位於富含HSA TR的區域。初始亞相濃度為[HSA-TR]=0.10 mg/mL和[F-127]=0.0050 mg/mL。比例尺：20μm。

粉色视频网站發現在HSA-TR/F-127混合物中，蛋白裏奇區表現出隨時間變化的形態變化，這促使粉色视频网站更詳細地研究這一動態現象。圖5所示的結果是通過將HSA-TR（0.50 mg/mL）與F-127（0.015 mg/mL）混合，聚焦在AWI上拍攝的圖像。圖5A顯示了將溶液用移液管移入腔室後35至60分鍾內聚焦在同一區域的三幅圖像。可見麵積為10-100μm2的小圓形蛋白質島。感興趣區域（ROI，由圖5中的黃色方框表示）突出顯示了一些有趣的觀察結果：在ROI-1中，與35分鍾時的圖像相比，小的蛋白質島在50分鍾時與周圍的蛋白質島結合形成一個更大的島。在ROI-2中，從50分鍾開始可以看到小黑洞，表明F-127在這些位點取代了HSA-TR，並在富含蛋白質的區域內形成空腔。在ROI-3中，可以觀察到表麵活性劑富集區前沿的移動。很明顯，隨著時間的推移，表麵活性劑富集區不斷擴大。在ROI-4中，小的蛋白質島合並成網狀網絡。

圖5。蛋白質島隨時間的聚合。（A）導入後35、50和60分鍾拍攝的共焦熒光圖像。比例尺：20μm.（B）蛋白質島大小分布的直方圖。初始亞期濃度為[HSA-TR]=0.50 mg/mL和[F-127]=0.015 mg/mL。ROI-1表示一個區域（黃色框），其中小的蛋白質島與周圍的蛋白質島結合形成一個較大的島；ROI-2表明該區域形成了小黑洞；ROI-3表示在表麵活性劑富集區域的邊界處的運動；ROI-4顯示了小的蛋白質島合並成網狀網絡的地方。

粉色视频网站使用ImageJ分析了蛋白質島的大小分布（圖5B）。31麵積分數定義為相同大小的蛋白質島的表麵積除以蛋白質島總麵積的總和。圖5B顯示了島嶼規模分布的明顯增長趨勢。蛋白質島的平均麵積從24μm2（35分鍾）增加到57μm2（60分鍾）。通過使用30幀/秒的更快掃描速率（支持信息中的電影S1，其中電影中的圖像顯示速度比實時慢10倍）也觀察到蛋白質島的運動，並且觀察到蛋白質島表現出類似於單層脂質結構域布朗運動的運動。42重要的是，觀察到鄰近島嶼在接觸時結合在一起。富含蛋白質的結構域的存在表明蛋白質和表麵活性劑在動力學過程中共同吸附到界麵。蛋白質分子之間的強相互作用促進了結構域的形成和結構域的合並，從而阻止了表麵活性劑的置換。然而，F-127的界麵占有率在熱力學上是有利的，其中F-127在0.015 mg/mL時的平衡表麵張力約為40 mN/m43，而HSA在0.50 mg/mL時的平衡表麵張力為52-60 mN/m。34因此，隨著時間的推移，蛋白質結構域逐漸被表麵活性劑從本體中置換，以降低表麵能。

表麵活性劑穿透蛋白質結構域的觀察和表麵活性劑富集區的擴展符合造山模型。該模型表明，表麵活性劑首先穿透蛋白質層，形成缺陷或孔洞，從而取代界麵上的蛋白質。然後，隨著表麵活性劑繼續在這些區域累積，表麵活性劑區域擴張，蛋白質層被迫彎曲並延伸到亞相，直到蛋白質層最終坍塌。1,19在肺表麵活性物質/聚乙二醇/白蛋白混合物中顯示了不同的置換機製，這表明競爭吸附過程可能依賴於係統。在表麵張力和表麵流變學研究中，44個理論模型已被開發用於解釋蛋白質/表麵活性劑混合溶液的吸附動力學和平衡狀態。41作為對這些研究的補充，粉色视频网站的工作提供了關於蛋白質和表麵活性劑在界麵上的位置以及組裝結構的更詳細信息。在粉色视频网站的研究中觀察到的聚結現象表明，相鄰的蛋白質結構域有重組連接網絡的趨勢，而其他蛋白質正被表麵活性劑取代，因此突出了HSA-TR/F-127混合物中蛋白質結構域聚結和表麵活性劑取代蛋白質的兩個競爭過程。

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