2. 實驗部分

2.1. 材料

純重組人胰島素、甲醇、氯仿和鹽酸從MP Biomedical，LLC（Solon，OH）獲得。 重組人胰島素（Catalog#199744，99.3%分析）已在大腸杆菌表達係統中產生，並使用親和純化進行純化。 所有化學品均為試劑級，使用時無需進一步純化。 用於子階段製備的水來自Modulab 2020水淨化係統（德克薩斯州聖安東尼奧大陸水係統公司）。 純化水的表麵張力為72.6 mN·m − 1在20.0±0.5°C，電阻率為18 MΩ·cm，pH值為5.6時。

2.2. 方法

FITC人胰島素結合程序。 通過FITC-HI的表觀熒光檢測HI-Langmuir單層的形貌。 由於胰島素是非熒光的，所以必須附加一個熒光團才能使用熒光顯微鏡。 常用的蛋白質探針是異硫氰酸熒光素（FITC）。

FITC共軛HI的製備方法如下。 在PBS溶液中分別製備FITC（1 mg/mL）和HI（0.3 mg/mL）溶液。 用鋁箔覆蓋FITC溶液和任何含有FITC的溶液，以防止熒光探針的光降解。 將FITC溶液逐滴加入胰島素溶液中並攪拌1小時。 這兩種溶液在FITC與胰島素的摩爾比為0.5:1至4:1的範圍內相互混合。 攪拌後，溶液通過G-25 Sephadex柱（球狀蛋白範圍：1×103至5×103 Da）按以下順序按重量分離：FITC-HI、HI和FITC。 當流經葡聚糖凝膠柱的其中一種組分的質量高於該範圍時，這些組分將首先流出。 G-25葡聚糖凝膠的最大範圍為5000da； 然而，HI的摩爾質量為5870 g mol − 1. 三個組成部分中有兩個高於5000 Da，即HI-FITC和HI。 因此，最重的組分HI-FITC將首先流出色譜柱，然後流出HI。 最輕的成分是FITC和FITC碎片，它們保留在柱的頂部，如柱頂部的亮綠色發光所示。 柱上的紫外光顯示三個不同區域：柱底部附近的熒光綠色區域，對應於FITC-HI，其上方的非熒光部分對應於未共軛於FITC的HI，以及柱頂部的熒光黃色區域，對應於未共軛於HI的FITC。 使用PBS緩衝液運行色譜柱，收集體積為1mL的等分試樣。

熒光光譜法用於選擇含有FITC-HI的小份樣品。 FITC探針在494nm激發時顯示出517nm的發射。 人們注意到，當探針與HI共軛時，FITC發射的強度增加。 吸收光譜法用於確定HI與FITC的比率，該比率由下式計算得出。21

其中MolWtHI=5870 g mol − 1和ε280，HI和ε495，FITC分別為17335和90000。 A495和A280分別是共軛物和HI在494和280 nm處的吸光度。 考慮到FITC在280 nm處的吸光度，校正係數為0.35×A495。 製備了各種共軛物（FITC x-HI），x代表每HI結合的FITC分子的平均數量。 一個已經準備好了1個 − 10個FITC分子與HI分子相連，但具有1個FITC分子的HI共軛物主要用於表觀熒光顯微鏡實驗。

朗繆爾單層製備。 Langmuir單層實驗中使用的HI溶液濃度為0.30 mg/mL，通過將HI粉末溶解在鹽酸水溶液（pH 2）中製備。 對於作為朗繆爾單層進行的所有實驗，亞相（純水）的pH值為5.6。 Kibron槽和KSV槽的鋪展液體積分別為80和40μL。 HI溶液在空氣中擴散 − 水界麵，使用100μL注射器（Hamilton Co.，Reno，Nevada），在亞相表麵均勻沉積小液滴，然後等待15分鍾，以使Langmuir單層達到平衡。 壓縮率設定為10mm·min − 1. 所有等溫線和原位紫外光譜 − 在溫度（20.0±0.5℃）和濕度（50±1%）保持恒定的潔淨室（1000級）中進行可見光、熒光和輻照光譜測量。

表麵化學和光譜學方法。 使用麵積為5.9 cm×21.1 cm的Kibronμ-槽（Kibron Inc.，芬蘭赫爾辛基）測量表麵壓力 − 麵積（π） − A） 等溫線 − 減壓周期和穩定性研究。 表麵電位 − 麵積（ΔV − A） 使用由電容式係統組成的開爾文探針在Kibron槽上獲得等溫線。 振動板設置在朗繆爾單層表麵上方約1 mm處，鍍金槽底座用作對電極。

空氣中的光譜測量 − 使用HP 8452 A型紫外分光光度計獲得水界麵 − vis和Fluorog-3熒光分光光度計（Horiba Scientific，愛迪生，新澤西州）用於熒光。 HI-Langmuir單層膜在空氣中的熒光光譜 − 使用麵積為0.25 cm2的分叉光纖測量水界麵，並將其放置在亞相表麵上方1 mm處。 激發光通過光纖從光源傳輸到朗繆爾單層膜，朗繆爾單層膜的發射光通過光纖傳回檢測器。 紫外線 − 在Perkin Elmer Lambda 900 UV/vis/NIR光譜儀（Norwalk，CT）和Fluorog-3熒光光譜儀（與用於Langmuir單層的熒光光譜儀相同）上分別使用1 cm光程長度的石英反應杯記錄水溶液的可見吸收光譜和熒光光譜。

表觀熒光顯微鏡用於觀察Langmuir單層（如有）中區域的形成。 顯微鏡需要在樣品台頂部放置朗繆爾槽。 石英窗允許激發光穿透亞相，以便在空氣中激發熒光團 − 水界麵。 實驗裝置使用Kibronμ-槽（Kibron Inc.，芬蘭赫爾辛基）和熒光顯微鏡（Olympus IX-FLA）相結合。 可用於鋪展溶液的麵積為5.9 cm×21.1 cm。 該熒光圖像由熱電冷卻光電Magnafire CCD相機拍攝。

布魯斯特角顯微鏡（BAM）用於觀察朗繆爾單層的形貌。 使用IElli-2000成像橢偏儀在關閉補償器和BAM2plus軟件的情況下進行測量。 IElli2000係統的標準激光器是倍頻Nd:YAG激光器（50 mW輸出），使用532 nm線。

使用JASCO J-810分光旋光儀獲得圓二色性（CD）光譜。 在25°C下，使用2.0 mm光程長度的石英電池，在195和250 nm之間記錄光譜。

水溶液的紅外光譜是使用衰減總反射率獲得的。 使用生物ATR輔助裝置，將水樣沉積在ATR晶體表麵，很容易獲得紅外光譜。 靜態模式隻需要15分鍾 − 20μL水溶液； 但是，水溶液的濃度應大於0.5 mg/mL，以確保與ATR晶體適當接觸。 水銀 − 鎘 − 碲化物（MCT）探測器（Kolmar Technologies）的掃描速度為5 kHz。 背景光譜為純水。 將生物ATR細胞II置於Bruker Optics Equinox55 FTIR的細胞室中。

紅外反射 − 使用EQUINOX-55傅裏葉變換紅外（FTIR）光譜儀（Bruker Optics，Billerica，MA）對Langmuir單層進行吸收光譜（IRRAS）測量，該光譜儀配備適用於空氣的XA-511外部反射附件 − 水界麵實驗。 紅外光束聚焦在空中 − Kibronμ-槽的水界麵。 反射的紅外光束進入了由液氮冷卻的HgCdTe（MCT）探測器。 獲得的光譜分辨率為8 cm − 1通過對1200個p極化掃描和800個s極化掃描的疊加。

人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表麵化學和光譜學性質——摘要、介紹

人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表麵化學和光譜學性質——實驗部分

人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表麵化學和光譜學性質——結果和討論

人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表麵化學和光譜學性質——結論、致謝！